Enzymtests mit Peptidchips und Massenspektrometrie

Entlarvende Gewichtszunahme

Zellteilung, Differenzierung, programmierter Zelltod – kein essenzieller zellulärer Prozess, bei dem sie nicht wichtige Regelfunktionen übernehmen würden: Proteinkinasen, Enzyme, die Phosphatgruppen an Proteine anhängen. Entsprechend wichtig für die biomedizinische und pharmakologische Forschung sind Erkenntnisse über die Aktivitäten der verschiedenen Mitglieder dieser Enzymklasse. Ein Team von der University of Chicago hat nun ein neues massenspektrometrisches Chip-Verfahren entwickelt, mit dem Kinaseaktivitäten rasch, unkompliziert und vor allem simultan bestimmt werden können.

Was man für einen Enzymtest braucht, ist ein passendes Substrat, in diesem Fall einen Proteinschnipsel (Peptid), an den die jeweilige Kinase ein Phosphat anzuknüpfen vermag. Solche Peptide fixierte das Forschteam um Milan Mrksich auf der Oberfläche von Chips – goldbeschichteten Glasplättchen, auf die eine Lage organischer Moleküle aufgebracht wird. Ein Teil dieser Moleküle wirkt wie ein molekularer Ankerplatz für Peptide.

Gibt man einen Tropfen einer Testmischung auf den Peptid-Chip, erkennt eine darin enthaltene Kinase ihr Substrat, stürzt sich darauf und knüpft an jedes Substratmolekül eine Phosphatgruppe an. Peptide mit Phosphat sind schwerer als Peptide ohne. Und diese Gewichtsdifferenz lässt sich mit Hilfe einer speziellen massenspektrometrischen Methode, die sich MALDI-TOF nennt, nachweisen. Und das funktioniert so: Mit Hilfe eines Laserstrahls werden einzelne Moleküle von der Chipoberfläche „geschossen“ und dabei ionisiert (elektrisch geladen). In einem elektrischen Feld werden die geladenen Teilchen auf einen Detektor zu beschleunigt. Schwerere Moleküle sind dabei langsamer als leichtere, so dass über die benötigte Flugzeit bis zum Detektor die Molmasse bestimmt werden kann. Das massenspektrometrische Spektrum des Chips zeigt dann ein Signal für das Peptid – mit oder ohne Phosphat.

Werden Peptide auf einem Chip verankert, die verschiedene Molmassen haben und ganz spezifisch nur für einen einzigen Kinasetyp als Substrat dienen, so lassen sich auch die Aktivitäten mehrerer Kinasen parallel in einem Versuch ermitteln – ein besonderer Vorteil dieser Methode.

Auch die Wirksamkeit von Kinase-Hemmstoffen, die beispielsweise als potenzielle Arznei in der Diskussion sind, lässt sich quantifizieren: Dazu wird eine Versuchsreihe in Anwesenheit der Kinase und verschiedener Hemmstoffkonzentrationen durchgeführt. Anhand der Signalverhältnisse für das Peptid mit und ohne Phosphat ergibt sich eine Dosis-Wirkungs-Beziehung für den Hemmstoff.

Kontakt:

Prof. M. Mrksich
Department of Chemistry
Institute for Biophysical Dynamics
The University of Chicago
5735 South Ellis Avenue
Chicago, IL 60637, USA
Tel.: (+1) 773-702-1651
Fax: (+1) 773-702-0805
E-mail: mmrksich@uchicago.edu