Protein zur chemoenzymatischen Herstellung von L-<i>threo</i>-Hydroxyaspartat

Die vorliegende Erfindung liefert ein neuartiges Protein, mit dem L-<i>threo</i>-Hydroxyaspartat chemoenzymatisch und enantiomerenrein aus L-Aspartat hergestellt werden kann.<p>

Das natürliche Protein AsnO (Asparaginoxygenase) ist Teil des CDA-Biosynthese-Genclusters in Streptomyces coelicor. AsnO ist eine Fe<sup>2+</sup>- und <font face=“symbol“>a</font>-Ketoglutarat-abhängige Hydroxylase. Diese Hydroxylase dient in vivo als Baustein für nicht ribosomal hergestelltes CDA (?Calcium-dependent antibiotic?). Während des Katalysezyklus verbindet diese Klasse von Enzymen den oxidativen Abbau von <font face=“symbol“>a</font>-Ketoglutarat zu Succinat und CO<sub>2</sub> mit der Hydroxylierung des Substrates (L-Asparagin).<p>

Im Wildtyp des AsnO bindet dabei die Seitenkette des Aminosäurerestes Asp-241 an die NH<sub>2</sub>-Gruppe der Carboxamidgruppe von L-Asn.<p>

Überraschend wurde gefunden, dass eine gerichtete Mutagenese von Asp-241 zu Asn-241 (D241N) zu einer Bindungsstelle für die Carboxylgruppe einer Aspartat-Seitenkette führt. Durch diese gerichtete Mutagenese ändert sich die Substratspezifität von Asparagin zu Aspartat, und das mutierte Protein überführt Aspartat in Gegenwart von Fe<sup>2+</sup>- und <font face=“symbol“>a</font>-Ketoglutarat chemoenzymatisch in L-<i>threo</i>-Hydroxyaspartat. <p>

Dabei ist AsnOD241N die erfindungsgemäße Mutante des Wildtyps AsnO.

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Dr. Peter Stumpf

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